DETERMINACIÓN DEL SISTEMA ABO (MÉTODO DIRECTO)

 Fundamento.

Para identificar los antígenos de los grupos sanguíneos del sistema ABO se utilizan anticuerpos específicos y su presencia se pone de manifiesto por la anticuagulacion de los eritrocitos.

La determinación puede hacerse en placas o en tubos sin embargo se recomienda en tubos , porque se facilita la observación de la reacción y con ello su interpretación.

MATERIAL BIOLOGICO	EQUIPO	RECTIVOS
Sangre sin anticuagulante 5ml	Centrifuga clínica	Suero hemotipificador Anti A
	Gradilla	Suero hemotipificador Anti B
	Tubos de ensayo de 10x75 o 12x75 mm	Suero hemotipificador Anti A,B
	Bulbos	Solución Isotónica de Cloruro de Sodio (NaCl) al 0.9%
	Pipeta Pasteur
	Marcadores
	Placa de vidrio o porcelana de 20x30 cm
	Aplicadores de madera

PROCEDIMIENTO

1)      Rotular los tubos con el umero de la muestra y la etiqueta Anti suero correspondiente.Ejemplo:

Muestra 1

Tubo No.1A será la muestra 1 con el reactivo Anti A

Tubo No.1B será la muestra 1 con el reactivo Anti B

Tubo No. 1AB será la muestra 1 con el reactivo Anti AB

Tubo No.1AT será la muestra 1 con su propio suero (autotestigo)

2)      Colocar con goteo correspondiente una gota de su suero hemotipificador (Anti A, Anti B, Anti AB) al tubo correspondiente , y dos gotas del suero de la muestra en estudio al tubo marcado AT

3)      Preparar una suspensión de eritrocitos al 5% lavado o sin lavar según se la situación. Eritrocitos sin lavar: del fondo del tubo que contiene el paquete globular se tomaran con una pipeta pasteur una gota , la cual se resuspendera con 19 gotas de Solucion salina agregar una gota de esta suspensión a cada uno de los tubos. Eritrocitos lavados:colocar 5 gotas de eritrocitos y llenar a la mitad del tubo don solución salina fisiológica(SSF) 0.9%, suspenda y centrifugue 1 minuto a 1000 rpm , tire el sobrenadante y repita la operación 3 veces, resuspende el botón en 19 gotas de SSF.

4)      Mezclar suavemente.

5)      Centrifugar los tubos 3400rpm 15 segundos o a 1000rpm 60 segundos.

INTERPRETACIÓN DE LAS AGLUTINACIONES OBSERVADAS:

Para la interpretación se deberá considerar el grado de aglutinación macroscópica de 0 a 4 cruces . Que se relaciona con la intensidad de aglutinación del paquete de eritrocitos  con el color del sobrenadante . Observar el tubo inmediatamente después de la centrifugación colocándolo de forma horizontal a la altura de los ojos y frente a una fuente de luz . El tubo se agitara suavemente desplazando la suspensión con el objeto de observar adecuadamente el grado de aglutinación.

No . cruces	Botón	Sobrenadante
4	Solido único	Claro
3	Un botón grande y varios pequeños o de 2 a 3 grumos grandes	Claro
2	Varios grumos medianos	Ligeramente rojo
1	Grumos pequeños con eritrocitos libres	Rojo
½	Escasos grumos muy pequeños como “arenilla”	Rojo
0	Nose observa	rosado

TÉCNICA DETERMINACION DE HEMOGLOBINA

 Determina la concentración de hemoglobina en una muestra sanguínea mediante espectrofotometría por el método de Cianometahemoglobina.

La hemoglobina es una proteína conjugada de color rojo , componente principal de los eritrocitos en un 31- 34 % DE SU PESO MOLECULAR APROXIMADAMENTE DE 65000 y sirve de vehículo para el transporte de oxigeno Y CO2.
Una molécula de hemoglobina consta de dos pares de cadenas de polipeptidos y cuatro grupos protéticos (hem) que contiene cada uno un átomo de hierro ferroso . cada grupo hem se localiza exactamente en una determinada zona de una de las cadenas de polipeptidos.
Existen varios metodos para la determinacion de la hemoglobina , como son : la hematina acida , hematina alaclina , oxihemoglobina , carbixihemoglobina y cianometahemoglobina.
El metodo de cianometahemoglobina es de eleccion por las siguientes razones:

a) El método mide Hb metHb coHb ; mide SHb

b) La cianometahemoglobina es estable en soluciones divididas

c) Existe en el mercado a estándares certificados de cianometahemoglobina

d) Las lecturas se pueden hacer el espectrofotómetros de uso común .

La sangre se hemolisa por agregado de un agente tensoactivo . Con el ferrisianuro de potasio (K3Fe(CN)6) se oxida el atomo de Fe** a Fe*** para producir metahemoglobina . El KCN estabiliza la metahemoglobina como cianometahemoglobina . La coloración producida directamente proporcional a la concentración de hemoglobina presente.

Esta técnica para llevarla a cabo se necesita lo siguiente:

MATERIALES	REACTIVOS	APARATOS
Tubos de ensaye de 13x100mm	EDTA al 10%	Espectrofotómetro
Pipetas serológicas de 5ml	Reactivo de Drabkin
Pipeta de Sahli	Sangre venosa con anticuagulante
Gradilla
Gasa
celdas

 Espectrofotometro: Un espectrofotómetro es un instrumento usado en el análisis químico que sirve para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra. Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra.

PROCEDIMIENTO

Con los materiales anteriores se realiza el procedimiento de la prueba siguiendo estos pasos:

1)colocar en un tubo de ensaye 5 ml de reactivo de Drabkin

2)mezclar perfectamente la sangre con el anticuagulante

3)llenar la pipeta de Sahli calibrada a 0.02 ml

4)limpiar la sangre adherida en el exterior de la pipeta y vaciar la sangre de la pipeta al liquido diluyente, enjuagando 3 veces la pipeta con el mismo liquido

5)mezclar perfectamente la sangre con el liquido

6)medir la extinción del problema contra la solución reactiva antes de 3 minutos a 540 nm.

VALORES NORMALES:

Altutud de residencia sobre el nivel del mar (m)	Criterios de exclusión o diferimiento
	Hombres	Mujeres
Entre 0 y 1500	<135g/l	<125g/l
1501 o mayor	<145g/l	<135g/l

       TECNICA DE HEMATOCRITO

        El hematocrito es uno de los métodos con el mayor valor estadístico , simple y exacto de la misma forma de la hemoglobina y el conteo eritrocitario, este es uno de los parámetros necesarios para determinar los índices eritrociticos :VGM , CMH , CMHC .

      

      El fundamento de esta tecnica es que el paquete celular y el plasma se separan al centrifugar la sangre a una velocidad y tiempo constante . El resultado mide el porcentaje de volumen de sangre total , que es ocupado por los eritrocitos . 

      Para realizar una prueba de hematocito necesitas lo siguiente :

MATERIALES	REACTIVOS
TUBO CAPILAR HEPARILIZADO	SANGRE VENOSA O CAPILAR
MECHERO
MICROCENTRIFUGA
LECTOR PARA MICROMETODO

Los aparatos que se utilizan en la practica son utilizados en laboratorios clinicos este es un metodo manual por lo que solo se utiliza MICROCENTRIFUGA y LECTOR PARA MICROMETODO.

Las centrífugas para hematocrito sirven ante todo para determinar la proporción porcentual volumétrica de eritrocitos en sangre. 

En este método la sangre se centrifuga en tubos capilares para hematocrito hasta que se alcanza la densidad máxima de compactación celular. Después de la centrifugación se efectúa la lectura del valor de hematocrito mediante un disco especial de evaluación.  

PROCEDIMIENTO

El procedimiento de esta practica se realiza siguiendo los siguiente pasos:

1)obtener sangre venosa o capilar .

2)con un tubo capilar heparilizado ,llenar con sangre dos terceras partes de tubo .

3)sellar con fuego directo la punta del extremo que no se lleno (si se sella por calor deberá ser el lado mas distante a la sangre con el objeto de no hemolizarla efectuando u movimiento de rotación)

4)introducir el tubo a la microcentrifuga durante 5000 r. p.m. durante 10 min.

5)al sacar el tubo de la centifuga se observan tres capas :

                      a) paquete celular rojo:eritrocitos

                     b) Paquete intermedio: leucocitos y plaqutas aglomeradas

                      c) plasma

6)al final se hara la lectura . Se coloca el capilar en el surco del lector de manera que la capa flogística o intermedia quede a la altura de la línea blenca del surco uy con el paquete celular dirigido hacia el indicador rojo , girar el disco a manera que el angulo de 90 grados de las líneas del disco abarquen los extremos de la muestra total de donde se inician la células al meisco del plasma .El resultado se lee en la escala inferior expresándolo en porcentaje.

VALORES NORMALES:

Altutud de residencia sobre el nivel del mar (m)	Criterios de exclusión o diferimiento
	Hombres	Mujeres
Entre 0 y 1500	<40%	<38%
1501 o mayor	<44%	<40%

Bibliografía

Henry . Todd-Sanford, Diagnotico Clinico por el  laboratorio , 6ª edición, Editorial Salvat Editores , Barcelona , 1978. NOM-253-SSA1-2012