Practica

 

PRUEBA DE VIH (TAMIZAJE POR INMUNOCROMATOGRAFÍA)

 

TECNICA DE PRUEBAS DE VIH

INTRODUCCIÓN

·      El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se ha reconocido como el agente etiológico del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA)

·      La mayoría de los pacientes con SIDA tienen anticuerpos para las proteínas estructurales del virus de VIH. Es más, una proporción de miembros de grupos de alto riesgo clínicamente saludables como los homosexuales, hemofílicos o adictos a las drogas son también cero positivos. La infección por VIH se diagnostica mediante la detección de anticuerpos específicos para el virus. Actualmente se conocen dos tipos de VIH: VIH-1 y VIH-2 con 40 – 60 % de aminoácidos homólogos entre las dos cepas.

·      Esta prueba es un inmunoensayo rápido para la detección de anticuerpos para el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 y 2 en suero, plasma o sangre completa.

FUNDAMENTO

·      Las proteínas recomendables representando las regiones de las proteínas de la cubierta del VIH-1 Y VIH-2, la glicoproteína gp41, gp120 y la glicoproteína gp36 (VIH-2) respectivamente son inmovilizados en la región de prueba de la tira de nitrocelulosa.

·      Estas proteínas también se unen al oro coloidal y se impregnan por debajo de la región de prueba del casete. Una banda delgada de la membrana de nitrocelulosa también se sensibiliza como una región control.

·      Durante la prueba se aplican dos gotas de suero, plasma o sangre total del área de la muestra , seguido de dos gotas de buffer de lavado y se deja que reaccionen . los anticuerpos IgG específicos para las proteínas recombinantes del VIH-1 y VIH-2 reaccionaran con los antígenos unidos a las partículas de oro coloidal. El complejo partículas de oro coloidal – anticuerpos se mueven cromatograficamente a través de la membrana a las regiones de prueba y control del casete de prueba. una reacción positiva se visualiza por una banda de color rosa/purpura en la región de la prueba del casete.

OBJETIVO

·      Que el alumno realice un inmunoensayo rápido para la detección de VIH

 

 

MATERIALES

Ø  Equipo vacutainer

Ø   torundas

Ø  1 tubo rojo

Ø  Cronometro o reloj

Ø  Equipo para prueba de VIH

Ø  Centrifuga

TECNICA

 

·      PRUEBAS DE VIH

 

1)       Obtener la muestra de sangre por puncion venosa

2)       Centrifugar a 2500 rpm por 5 min para obtener el suero

3)       Marcar cada prueba con la información apropiada al paciente

4)       Tomar dos gotas del suero (aproximadamente 6ul) utilizando la pipeta proporcionada en el quipo y colocarlas cuidadosamente en el área de prueba de casete (dispositivo de prueba)

5)       Adicionar dos gotas ( aproximadamente 60 ul) del reactivo de lavado al área de muestra

6)       Permitir que trnscurran exactamenten 10 min para que la reacción ocurra. El resultado se debe leer exactamente al final de los 10 min del tiempo de incubación. Este es estable aproximadamente durante 5 a 10 min.

INTERPRETACIÓN

a)       El resultado es positivo: aparece en una línea rosa/purpura de cualquier intensidad en el área de prueba (T) y una línea en el área de control.

b)      El resultado negativo: aparece solo una línea en el área de control

v  El resultado es inválido en ausencia de una línea en el área de control. La prueba se debe repetir con un dispositivo nuevo independientemente de que aparezca una línea en el área de prueba.

Practica

 

DIAGNÓSTICO DE TREPONEMA PALLIDUM POR EL MÉTODO DE VDRL

 

 

 

TECNICA DE DIAGNÓSTICO DE TREPONEMA PALLIDUM POR EL MÉTODO DE VDRL

                                       

OBJETIVO

·      El alumno diagnosticará la presencia de sífilis en una muestra de suero a través de la prueba de VDRL.

INTRODUCCIÓN

·      La sifilis pocas veces se diagnostica mediante la determinación de organismos en una lesión primaria o secundaria. la serología constituye el método de laboratorio más comúnmente utilizados en el diagnóstico de esta enfermedad.

·      La serología de la sífilis se basa normalmente en dos grupos generales de procedimientos: 1) las pruebas de antígenos no treponemicos de las cuales el VDRL constituyen un ejemplo principal y 2) las pruebas de antígeno treponemico fluorescente absorbido ( FTA- ABS).

PROCEDIMIENTO:

FUNDAMENTO

·      La reagina es una sustancia que aparece en la sangre y líquido céfalo raquídeo de personas que padecen sifilis y otras enfermedades, como el mal del pinto, lepra y paludismo por señalar las más importantes. esta sustancia flocula las emulsiones de una solución alcohólica al 0.03% de cardiolipina, 0.09% de colesterol y lectina suficiente para estandarizar su reactividad. dicha solución se utiliza como antígeno.

MATERIALES

Ø  Suero sanguíneo

Ø   Placas de vidrio

 

REACTIVOS

Ø  KIT PARA DETERMINAR VDRL

 

 

 

·      TECNICA DE LA PRACTICA

v  El suero obtenido por la centrifugación se calienta a 56°C durante 30 min o a 62°C durante 3 min. Si el suero tuviera impurezas centrifugar nuevamente.

 

·        REACCIÓN CUALITATIVA

 

1)       Medir 0.05ml del suero inactivado y colocado en la placa de vidrio

2)       Añada una gota de emulsión del antígeno a cada suero

3)       Haga la rotación de la placa durante cuatro min. Si la rotación se hace a mano se debe realizar sobre una mesa o superficie plana

4)       Las reacciones se leen inmediatamente después de la rotación.

INTERPRETACIÓN

vPOSITIVO: GRUMOS MEDIANOS Y GRANDES

vNEGATIVO: NO HAY GRUMOS

vPEQUEÑOS GRUMOS SE DEBEN REPORTAR COMO DÉBILMENTE POSITIVO

 

Practica

 

DIAGNÓSTICO DE BRUCELLA POR EL MÉTODO DE ROSA DE BENGALA

 

TECNICA DE DIAGNÓSTICO DE BRUCELLA POR EL MÉTODO DE ROSA DE BENGALA

                                       

OBJETIVO

·      Realizar la prueba de rosa de bengala para una muestra de sangre con el fin de detectar la presencia y Brucella.

INTRODUCCIÓN

·      La brucelosis, conocida también como fiebre de malta, fiebre ondulante, enfermedad de bag o fiebre del mediterráneo, es una zoonosis ocasionada por bacterias del genero Brucella, cuyas especies patógenas para los animales son B. Melitensis, B.Abortus, B.suis, B. Canis y B. Ovis que afecta preferentemente a cabras, vacas, cerdos, perros y ovinos; la B. Melitensis es la más común en el humano, siendo poco frecuente la B. Canis. No se an comprobado casos en humanos, por B. Ovis y B. Neotomae.

·      La brucelosis en el hombre se trasmite por la ingesta de leche, sus productos y derivados contaminados, no pasteurizados, por contacto con productos, subproductos y desechos como tejidos o excreciones de animales enfermos, y por incubación de brucelas o inhalación del polvo de corrales o mataderos, donde estas se encuentran; de ahí que entender animales que se sospeche que han estado en contacto con el agente, manipular carne y viseras de animales infectados y trabaja en laboratorios, se consideren actividades ocupacionales de alto riesgo.

PROCEDIMIENTO:

FUNDAMENTO

·      La prueba se basa en la inhibición de algunas aglutinaciones inespecíficas a pH bajo. Se emplea un antígeno corpuscular de 8% de concentración celular en una solución tope a pH 3.65.

 

MATERIALES

Ø  Suero sanguíneo

Ø   Placas de vidrio

Ø  1 pipetas pasteur c /bulbo

Ø  1 centrifuga  

REACTIVOS

Ø  REACTIVO ROSA DE BENGALA (las casas comerciales suministran quipos completos con instrucciones detalladas)

 

·      TECNICA DE LA PRACTICA

·      En líneas generales, la prueba se realiza en la forma siguiente:

 

1)       Colocar 0,3 ml de plasma o suero problema sobre uno de los cuadros de la lámina de vidrio ( o tarjeta de cartón, lamina de plástico, etc.)

2)       Colocar una gota (0,3ml) de antígeno rosa de bengala (de card – test) cerca de la gota de suero.

3)       Mesclar bien el suero y el antígeno utilizando un agitador o mondadientes distinto para cada muestra. La superficie ocupada por la muestra debe tener un diámetro de 23ª 24 mm.

4)       Hacer girar la lámina o tarjeta durante 4 min a razón de 10 -12 movimientos por minuto. Esto se puede hacer en forma manual o con rotadores diseñados especialmente.

5)       El resultado de la prueba se lee a los 4 min sobre un fondo blanco. Las reacciones positivas presentan grumos de aglutinación, que pueden ser grandes o pequeños.

6)       La prueba es cualitativa, por lo que el resultado se informa como positivo o negativo

v  IMTERPRETACIÓN

a)       AGLUTINACION : POSITIVO

b)      NO AGLUTINACION: NEGATIVO

 

Practica

 

INVESTIGACIÓN CON CÉLULAS CONTROL DE COOMBS EN LA PRUEBA CRUZADAS PRE TRANSFUSIONAL

 

TECNICA DE INVESTIGACIÓN CON CÉLULAS CONTROL DE COOMBS EN LA PRUEBA CRUZADA PRE TRANSFUSIONAL

                                       

OBJETIVO

·      Que el alumno aprenda a fijar un anticuerpo en la membrana del eritrocito. Al utilizar estos eritrocitos sensibilizados en las pruebas cruzadas que hayan resultado compatibles, convertirá una prueba negativa en positiva.

FUNDAMENTO

·      En esta prueba se fija sobre el determinante antigénico de eritrocitos O, anticuerpos (anti-D). estos eritrocitos al encontrarse en un medio con reactivo de coombs, este forma un puente entre los eritrocitos cercanos, produciendo aglutinación.

GENERALIDADES

·      Esta prueba fue descrita por primera vez en 1908 por Mc. Reschi y años más tarde en 1945 por coombs, Mourat y Race, aplicándola en la identificación de aglutininas Rh débiles e incompletas. El suero de coombs es una anti globulina humana, preparada por inmunización de animales (conejos o cabras a los que se les inyecta suero humano o las fricciones de este, los anticuerpos incompletos, entre ellos los que explican la eritroblastosis fetal y la anemia hemolítica adquirida, se adsorbe o se une al antígeno Rh fijos en la membrana del eritrocito, pero no los aglutinan, el suero anti globulina humana, permite reconocer estos globulos sensibilizados, al combinarse con los anticuerpos incompletos que ya cubren en la superficie con lo cual se produce la aglutinación.

·      Puesto que el suero humano contiene anticuerpos que pueden interferir en la prueba y pueden neutralizar el suero de coombs, es necesario eliminar totalmente el suero de la muestra sanguínea, mediante lavados repetidos con solución salina.

·      No se utilizan los sueros de sujeto A o B porque las substancias específicas de estos, tendrían de suero de coombs con anticuerpos contra las aglutinas a y b, los anticuerpos recubren con frecuencia los eritrocitos, pero no forman la malla necesaria que produce la aglutinación; como es el caso de anticuerpos dirigidos a los determinantes Rh sobre los eritrocitos humanos sin embargo la adicción de un antisuero anti globulina producido por una especie heteróloga, produce marcada aglutinación.

·      La prueba de anti globulina se usa principalmente para identificar cantidades sus aglutinantes o no aglutinantes de los anticuerpos anti eritrocitos.

 

MATERIALES Y EQUIPOS

Ø  1 gradilla

Ø   4 tubos de ensaye 10x75

Ø  2 pipetas pasteur c /bulbo

Ø  1 centrifuga serofuge

Ø  Baño María a 37°C

Ø  Suero de coombs

Ø  Solución salina en pizeta

Ø  Glóbulos rojos tipo O

 

 

·      TECNICA DE LA PRACTICA

 

1)       En un tubo de ensaye, se ponen dos gotas de globulos rojos O, cuatro gotas de solución salina y dos gotas de suero anti – D

2)       Se incuba el tubo a 37°C durante 30 min.

3)       Lavar en tres ocasiones con solución salina a 3400 rpm, durante 15 seg en cada ocasión

4)       Para provocar que los eritrocitos se encuentran sensibilizados, se toma una gota de la mezcla en otro tubo y se le agrega una gota del reactivo de coombs, se centrifuga a 3400 y si se aglutinan, están listos para usarse

5)       Se agrega una gota de los globulos rojos O sensibilizados a cada uno de los tubos en que se realizó el coombs en las pruebas cruzadas

6)       Se centrifugan y se observa si existe aglutinación

 

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

v  Si las pruebas cruzadas resultaron compatibles y estuvieron correctamente realizadas, al agregar las células control de coombs se observara aglutinación.

a)       EN CASO DE NO ENCONTRAR AGLUTINACION, SE PROCEDERA A REPARTIR TODAS LAS PRUEBAS CRUZADAS, PUES EXISTIÓ UN ERROR EN LA MANIPULACIÓN O EN LA AGRUPACIÓN SANGUINEA

      

Practica

 

PRUEBA DE COOMBS

 

 

 

TECNICA DE PRUEBA DE COOMBS

                                       

OBJETIVO

·      El alumno conocerá los eritrocitos sensibilizados  por anticuerpos incompletos, que son capaces de ser aglutinados por la anti globulina humana.

 

GENERALIDADES

·      El suero de coombs permite establecer la presencia de globulina y por lo tanto de anticuerpos, ya que son de la misma naturaleza. Los anticuerpos incompletos como son los que producen la eritroblastosis fetal y la anemia hemolítica adquirida, se observen sobre la superficie del glóbulo rojo; pero no los aglutinan el suero anti globulina permite reconocer estos globulos sensibilizados al combinarse con los anticuerpos globulínicos que ya cubren. Es útil reconocer estos globulos sensibilizados al combinarse con los anticuerpos globulínicos que ya cubren su superficie el suero de coombs es ideal pues tiene anticuerpos contra las globulinas séricas humanas que abarcan 4 grandes alfa 1, alfa 2, beta y gamma, dentro de estos grupos se encuentran anticuerpos anti Rh incompletos, anti-duffi, anti kell el suero de coombs se obtiene por inyecciones repetidas de sueros humanos del grupo O a conejos el animal sensibilizado de esta manera produce anticuerpos contra la fracción globulínica  de las proteínas séricas y contra anticuerpos incompletos que pueden encontrarse revistiendo a los hematises o bien es suspensión en el plasma, por lo que se llama antiglobulinas humana, se preparan reactivos de amplio espectro mediante la mezcla de sueros obtenidos de distintos animales

·      La IgG no produce aglutinación de los eritrocitos, pero se fijan sobre ellos y permanecen sin soltarse, al agregar el suero de coombs se forman puentes entre los fragmentos cercanos y es posible ver la aglutinación, revelando que esos eritrocitos estaban en realidad cubiertos de anticuerpos.

PRUEBA DE COOMBS DIRECTA

·      FUNDAMENTO: La prueba directa se realiza cuando el anticuerpo se ha fijado sobre el eritrocito “in vivo”, permite establecer la sensibilización de los globulos rojos que tuvo lugar en el organismo. Se usan para el diagnóstico de eritroblastosis fetal, anemia hemolítica y reacciones hemolíticas postrasfucionales por sangre incompatible

MATERIAL Y EQUIPO

Ø  1 gradilla

Ø  4 tubos de ensaye 13 x100

Ø  2 tubos de 10x 75

Ø  2 pipetas pasteur c/bulbo

Ø  1 centrifuga serofuge

Ø  1 baño maria 37°C

Ø  Solución salina en pizeta

Ø  Suero de coombs

Ø  Glóbulos rojos problema

Ø  Glóbulos rojos O Rh negativo

 

 

·      TECNICA  COOMBS DIRECTA

·      Para identificar  los glóbulos rojos sensibilizados es necesario remover la totalidad del suero de los eritrocitos, mediante lavadas repetidas con suero salina. Este proceso es importante, pues si se dejan residuos proteicos se neutraliza el suero de coombs y se obtendrán falsos negativos.

 

1)       Se prepara una suspensión de glóbulos rojos al  5 % de la cual se colocan dos gotas en un tubo de ensaye y se produce al lavado por tres ocasiones

2)       Después del ultimo lavado se re suspenden los glóbulos rojos nuevamente con una gota de solución salina, agregar dos gotas de suero de coombs  y mezclar.

3)       Incubar por 30 min a 37°C, extraer el tubo cuidadosamente y observar si existe aglutinación en el fondo del tubo con leves movimientos de inclinación

4)       Se aconseja como testigo utilizar hematíes de adulto no sensibilizados del mismo grupo del paciente. el testigo se prepara en un tubo poniendo una gota de sangre O Rh, incubar media hora, lavar por tres veces estos glóbulos y después se adiciona una gota de suero de coombs.

 

v  INTERPRETACION DE RESULTADOS

a)       SI EL TUBO PROBLEMA PRESENTA AGLUTINACION, LOS GLOBULOS ROJOS ESTAN SENSIBILIZADOS POR ALGUN ANTICUERPO INCOMPLETO.

PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA

FUNDAMENTO:

·      En esta prueba la sensibilización se realiza in vitro, en la primera etapa se sensibilizan los glóbulos rojos testigos con el anticuerpo que se desea investigar (Rh negativo, factor kell, diego, etc.) y en la segunda etapa por medio de reactivo de coombs se hace visible la sensibilización por medio del fenómeno de aglutinación macroscópica

TECNICA

 

1)       En tubo poner cuatro gotas del suero problema y una gota de globulos rojos sensibilizados, suspendidos en solución salina al 5%, si se investigan anticuerpos Rh se usan glóbulos rojos tipo O Rh positivos

2)       Se incuban a 37°C por una hora, se centrifuga el tubo a baja velocidad 2500rpm x 1 min

3)       Se lavan los glóbulos rojos sensibilizados tres veces con solución salina desechando el  sobrenadante completamente en el último lavado, dejando solo el botón de eritrocitos en el fondo

4)       Agregar dos gotas de suero de coombs, mezclar perfectamente y poner en baño maría a 37°C, durante 5 min

5)       Centrifugar a velocidad 2500 rpm y buscar aglutinación en el fondo del tubo

 

v  INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

b)      SI SE ENCONTRO AGLUTINACION DESPUES DEL PASO 2. INDICAR LA PRESENCIA DE AGLUTINAS ANTI Rh EL SUERO PROBLEMA.

c)       SI LA PRUEBA ES NEGATIVA. SE PUEDE PRESUMIR  LA EXISTENCIA DE ANTICUERPOS INCOMPLETOS O BLOQUEADORES, Y SE COMPRUEBA PROSIGUIENDO CON LA TECNICA

d)      SE PUEDE REALIZAR DILUCIONES DEL SUERO PROBLEMA PARA CONOCER EL TITULO DE AGLUTININAS ANTI- Rh QUE EXISTEN EN EL PACIENTE.